RACE = rapid amplification of cDNA ends

PCRを応用してcDNAの3'-末端を取得する方法である。
使用しているキットは宝酒造の3'-full RACE core setである。

☆Protocol!☆

 
 

 1) 試料とするtotal RNAを精製。最低1μg必要

 2) 反応系(total 20μL、200μL容のPCR tube)

　  8.5μL　　RNase free H2O
 　　 2μL　　10×RNA PCR Buffer
 　　 4μL　　25 mM MgCl2
 　　 2μL　　2.5 mM each dNTP mixture
 　　 1μL　　AMV reversetranscriptase XL (5 U)
 　 0.5μL　　RNase inhibitor (20 U)
　　  1μL　　Oligo dT-3sites adopter primer
 　　 1μL　　total RNA (1μg/μL)

 3) Thermal Cyclerで逆転写反応を行う。
　　30℃、10分→50℃、30分→5℃、5分（1サイクルのみ）

 4) 逆転写反応溶液をそのままPCRに用いる。下にLASAP2の3'-RACE成功時の反応系を示す。なお、逆転写反応液は下の量を上限と考えた方がよい。

　   20μL　　dH2O
 　　10μL　　5× Buffer B (elongaseに添付)
 　　10μL　　RT反応液
 　　 6μL　　2.5 mM each dNTP mixture
 　　 1μL　　3'-sites adaptor primer*
　　  1μL　　SAP2-RT5S (20 pmol)
 　　 1μL　　Elongase (Gibco BRL.)

      94℃、1分→55℃、3分→72℃、5分 (30 or 60 cycle)
　　　　↓
　　　4℃、Hold

 5) PCR溶液の一部を取り、電気泳動により確認する。
 

* 3'-sites adaptor primerにはBamHI siteなど制限酵素部位ができるようにデザインされている。目的とする断片の既知の配列を利用して、制限酵素部位ができるようにデザインしておけば、後のサブクローニングが容易になる。
 

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