植物のGenomic DNAは通常メチレーションなど修飾されていることが多く、制限酵素によっては全く切れないこともある。また、制限酵素によっては6塩基認識で期待される1/（4の6乗）以上の確率でサイトが頻出することがあり、完全分解後にGenimic Southern Blot Analysisを行うには不適切な場合も考えられる。そこで、抽出したDNAを1-2μg程度使って分解状況を確認する必要がある。切断は1時間〜4時間行い、0.8％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行う。ゲルの下端にBPBのバンドがきたところでやめると様子がよくわかる（BPBのバンドはだいたい0.8kb程度）。

１）上記Step2で決定した制限酵素を用いてGenomic DNAを完全分解する。制限酵素は3種類以上を選ぶこと。Genomic DNAの必要量は試料となる生物のゲノムサイズにより異なる。成功例としてはタバコで10μg、ルーピンで20μg、タマネギで30μgなど（いずれもnon RIの方法）。

２）制限酵素処理後、失活（酵素により異なる）、エタノール沈澱、リンス、風乾

３）0.8%アガロース（SeaKem GTG agarose）のゲルを用意する。大きいゲルの方が分離がよい。

４）ウェルのサイズに合わせて試料をTEに溶解し、泳動用色素を加える。ゲルの穴からあふれないように試料をアプライする。

５）20Vの一定電圧で電気泳動。通常一晩以上かかる（ゲルの長さが15cm程度の場合）。BPBのバンドがゲルの下端まで来たら停止する。

１）DNAを電気泳動したゲルを酸変性液（0.25 N HCl）に浸漬

２）室温で7〜10分間緩やかに振盪。BPBが黄色くなる

３）脱塩水で洗浄

４）アルカリ変性液に浸漬

５）室温で15分間緩やかに振盪。BPBが再び青くなる

６）アルカリ変性液に浸漬

７）室温で15分間緩やかに振盪

８）脱塩水で洗浄

９）中和液に浸漬

１０）室温で30分間緩やかに振盪

１１）両袖を10×SSCに浸した3MM濾紙の上にゲルを載せる

１２）ゲルの大きさより上下左右それぞれ2 mmずつ短く切っておいたHybond-N+をゲルの上に載せる

１３）サンプルスロットの位置に印をする

１４）フィルターの大きさより上下左右それぞれ2 mmずつ小さく切っておいた3MM濾紙を２枚フィルターの上に載せる

１５）更に上下左右それぞれ2 mmずつ小さく切っておいたペーパータオルを5 cm程重ねて載せる

１６）板と重しを載せ、4〜20時間静置

１７）ペーパータオルと濾紙を捨て、ゆっくりとフィルターを剥がす

１８）3MM濾紙上に移し、60℃で10分間通風乾燥

１９）クロスリンカーでブロット面にUV照射

２０）分子量マーカーのバンドに鉛筆で印をする

２１）直ぐに使わないときはハイブリバッグに封入して保存

Step 5 ハイブリダイゼーション
 

RIの方法は未検討。non RIのキットで十分うまくいく。

non RIでのハイブリダイゼーションのページはこちら。