広島県組織再生プロジェクト　毛髪研究グループ研究員　齋藤　実さんからのコメントです。

さて、PCRプロダクトからプローブを作成する時にPAGEをしてその後ゲルからのDNA抽出をする必要がありますがその方法が見あたりませんね。

キットなどを用いないで精製できる方法を埼玉大学に在学しているときに習いましたので失礼とは思いますが投稿いたします。

秀潤社のイラストレイテッドシリーズにもPAGEからの抽出法は載っていないようですね。

アガロースゲルからの切り出しでは精製度が低いためにnon-specificのバンドが形成されてハイブリがうまくいかないことがしばしばです。

どうもありがとうございます。大変参考になると思います。

場合によっては、アガロースゲル電気泳動後にも応用できるかもしれません。

かなりゲルが固くないといけないかもしれませんが。

下にプロトコールを掲載します。

Protocol

１）数百baseのPCR productsをP/C/I処理、EtOH沈殿によって酵素等を除く。

２）5％ポリアクリルアミド、1ｘTBEゲルで電気泳動（100Ｖ、60分程度）。

３）バンドを切り出しトランスイルミネーターで写真を撮り、ゲルを透析チューブに 入れ、200ulの1ｘTBEを入れ閉じる。

４）Mupidに1ｘTBEを満たし、チューブを沈めて100ｖ、60min、電流を反対向きにして5min通電。

５）チューブ内の1ｘTBEを回収し、チューブの中を1ｘTBEで洗う。

６）ゲルの写真を撮り（UV照射によって）、バンドが残っていないことを確認。

７）洗った液と併せてP/C/I処理、EtOH沈殿。

８）確認のため電気泳動。

colony PCRは現在のところpBluescriptにサブクローニングした時には確実にうまくいっている。colony PCRでスクリーニングして、インサートが含まれるものについてGFX Columnによるプラスミド精製を行って、シーケンスを行うことができる。

Protocol（20サンプル分＝1本は必ずブランクとすること）

１）dH2O 58μl, 10x PCR Buffer 20μl, dNTP 16μl, Foward Primer (50 pmol/μl) 2μl, Reverse Primer (50 pmol/μl) 2μl, Gene Taq (Nippon Gene) 2μlを混合して予め用意

２）19本のチューブ（1.5 or 0.5 mL 高速遠心チューブ）に50μlのdH2Oを入れ、番号をふっておく

３）白コロニーを滅菌爪楊枝またはクリスタルのチップでつつき、レプリカ用のプレートに移してから２）のチューブに移す

４）３）のチューブを軽く振盪

５）0.2μl容PCRチューブを20本用意し、１）の溶液を5μlずつ分注

６）５）のそれぞれのチューブに４）で用意した大腸菌懸濁液を5μlずつとる

７）液を底に落としてから次の系でPCR反応を行う

　　94℃、10秒-5分（1サイクル）

　　94℃、30秒--->60℃、30秒--->72℃、1分以上（35サイクル）

　　4℃（hold）

伸長反応のに時間については東大医学部第2生化学のホームページによれば3+2*x 分(x = insert の長さ(kb))とある。実際には和崎の結果では2 kbのインサートで5分で伸長している。

平滑末端を生じる制限酵素であるSmaIで切断したpBluescript SKに、Taq polymeraseで3'-末端にTを付加することでT-vectorを調製した。これに安達君のPCR産物をdirectにligation, transformationを行ったところ、white colonyが幾つか生じた。4つのコロニーを拾って確認したところ、そのうち一つにインサートが確認された。

ProtocolはPCRの項目のところへ。