in vitro packaging〜プレーティング



  • in vitro packaging
    in vitro packagingにはGigapackIII Gold (STRATAGENE)を用いる。


    １）乾燥サンプルに2.5μlのTE溶液を加える

    ２）Packaging Kitを加え、緩やかに混和

    ３）22℃に2時間放置（これを超えてはいけない）

    ４）500 μlのSM溶液、20 μlのクロロホルムを加えて軽く撹拌

    ５）軽く遠心して上清を取る

    ６）20 μlのクロロホルムを加えて軽く撹拌

    ７）4℃に保存



  • 宿主菌の培養


    １）宿主菌のグリセロールストック（-80℃、30％グリセロールに懸濁）をNZY plateにプレーティング

    ２）37℃で一晩静置培養

    ３）single colonyを滅菌した爪楊枝でつつき、8 ml NZYMMの入った50 ml三角フラスコへ移す

    ４）37℃で一晩振盪培養

    ５）8,000 rpmで3分間遠心

    ６）沈澱を3 mlの10 mM MgSO4に懸濁して宿主菌液とする



  • 作製したライブラリーのpfu (plaque formation unit)の測定


    １）ライブラリーのファージ液の10倍から10000倍（適宜調整）の希釈液をSM溶液で調製

    ２）各々１ μlずつ4 ml容のチューブに取る

    ３）10 mMのMgSO4に懸濁した宿主菌を100 μl加える

    ４）37℃に15分間インキュベート

    ５）予め融解して45℃にしておいた3 mlのNZYMM Top agaroseを加え、手早く転倒混和し、丸形のNZYMM寒天プレート（必ず予め37℃に保温）に注ぐ

    ６）10から20分間室温で静置してアガロースの固まるのを待つ

    ７）37℃で一晩静置培養

    ８）培養により生成したプラークの数を数え、pfuを算出



  • 角形シャーレへのプレーティング（マスタープレート作成）


    １）ファージ液（10,000 pfu程度）を300μl宿主菌と混合

    ２）37℃に15分間インキュベート

    ３）予め融解して45℃にしておいた8 mlのNZYMM Top agaroseを加え、手早く転倒混和し、角形のNZYMM寒天プレート（必ず予め37℃に保温）に注ぐ

    ４）10から20分間室温で静置してアガロースの固まるのを待つ

    ５）37℃で一晩静置培養

    ６）プラークの大きさが0.1-1 mmのところでプレートの周囲をパラフィルムでシールして4℃に保管（少なくとも2〜4週間保存可能）