２）95℃で10分間煮沸して変性
３）5分間硫安氷（およそ-14℃）またはEtOH氷などに漬けることで急冷
４）4 μlの滅菌水、キットに付属のHexanucleotide Mixture、dNTP Labeling Mixtureをそれぞれ2μlずつ加え、軽く遠心して全ての溶液をチューブの底に集める
５）1 μlのKlenow Enzymeを加え、緩やかに撹拌
６）37℃で1時間以上インキュベート
７）pH 8.0の0.2 M EDTAを2 μl加えて反応を停止
８）2.5 μlの4 M LiCl、75 μlのエタノール (-20℃)を加えてエタノール沈澱
９）リンス、減圧乾燥
１０）50 μlのTEに溶解
１）ラベルしていないプローブの溶液を希釈して、20 ng/μl、2 ng/μl、0.2 ng/μl、20 pg/μl、2 pg/μl、0.2 pg/μlの濃度のものを用意
２）それぞれに等量の20× SSC (3 M NaCl, 0.3 M Citrate 3Na)を加え、混合
３）ナイロン膜であるHybond-N+（Amersham）に7カ所印をし、1カ所にはそれぞれのキットに付属の非ラベルコントロールDNAを1 μl、残りの6箇所に先のプローブ溶液をそれぞれ1μlずつスポット
４）60℃で通風乾燥
５）アルカリ変性液(0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl)に5分間浸漬
６）キムタオルで水分を除去
７）中和液（1.5 M NaCl、0.5 M Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 7.2）に1分間浸漬
８）キムタオルで水分を除去
９）中和液に1分間浸漬
１０）60℃で10分間通風乾燥
１１）スポット面にトランスイルミネーターでUV照射、5分間（DNAのクロスリンク）
１２）後述する方法でハイブリダイゼーション、及び検出をする。ハイブリダイゼーションには標識プローブの溶液を1 μlだけ用いる
プレハイブリダイゼーション
１）Prehybridization Solutionはkitの説明書通りに、5× SSC、1% Blocking Reagent、0.1% (w/v) N-Lauroylsarcosinate、0.02% SDSのものを調製（サンプルがRNAの時は50% (v/v)でホルムアミドを含む）
２）ベーキング、乾燥しておいたフィルターをハイブリバッグに封入
３）20 mlのPrehybridization Solutionを満たす
４）ポリシーラーを用いて空気を出来るだけ追い出して封をする
５）60℃（ホルムアミドを含む時は42℃）で４時間インキュベート
ハイブリダイゼーション
１）プレハイブリダイゼーションが終わる迄に、DIG標識プローブ2 μlを0.6 ml容の高速遠心チューブに入れ、95℃で10分間煮沸
２）氷上で急冷
３）氷冷しておいた100 μlのPrehybridization Solutionを加え、混合
４）プレハイブリダイゼーション終了後、別のハイブリバッグにフィルターを移し、2 mlのPrehybridization Solutionを加える
５）３）の溶液を加える
６）ポリシーラーを用いて空気を出来るだけ追い出して封をする
７）60℃（ホルムアミドを含む時は42℃）に15時間インキュベートしてハイブリダイゼーションを行う
フィルターの洗浄と検出（発色法）
１）15時間のハイブリダイゼーションの後に、100 mlの2× SSC、0.1% SDSの溶液に30秒間浸漬
２）この溶液を捨て、200 mlの同じ溶液を加えて室温で15分間緩やかに振盪
３）この溶液を捨て、200 mlの同じ溶液を加えて室温で15分間緩やかに振盪
４）この溶液を捨て、100 mlの0.5× SSC、0.1% SDSの溶液に30秒間浸漬
５）この溶液を捨て、200 mlの同じ溶液を加えて65℃で15分間緩やかに振盪
６）この溶液を捨て、200 mlの同じ溶液を加えて65℃で15分間緩やかに振盪
７）この溶液を捨て、200 mlのWashing Buffer（100 mM マレイン酸、150mM NaCl、0.3%(v/v)Tween-20R、pH 7.5）を加えて室温で5分間緩やかに振盪
８）この溶液を捨て、Buffer 2（1% Blocking Reagent、100 mM マレイン酸、150 mM NaCl、pH 7.5）で軽く濯ぐ
９）200 mlのBuffer 2を加え、室温で30分間緩やかに振盪してフィルターを平衡化する
１０）この間にAnti-DIG-AP conjugateをBuffer 2に5000倍に溶解
１１）平衡化したフィルターをハイブリバッグに移す
１２）20 mlの１０）を注入
１３）ポリシーラーを用いて空気を出来るだけ追い出して封をする
１４）30分間緩やかに振盪
１５）フィルターをハイブリバッグから出し、200 mlのWashing Bufferの入った容器中において室温で15分間緩やかに振盪
１６）この溶液を捨て、200 mlのWashing Bufferを加えて室温で15分間緩やかに振盪
１７）この溶液を捨て、20 mlのBuffer 3（100 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、50 mM MgCl2、pH 9.5）を加えて室温で10分間緩やかに振盪してフィルターを平衡化する
１８）この間に15 mlチューブに9.8 mlのBuffer 3を取り、200μlのNBT/BCIP(Nitroblue Tetrazolium Salt/5-Bromo-4-chloro-3-indolyl Phosphate）溶液 を加え、混合
１９）平衡化したフィルターをハイブリバッグに移す
２０）10 mlの１８）を注入
２１）ポリシーラーを用いて空気を出来るだけ追い出して封をする
２２）振盪せずに暗所で発色
２３）発色完了の後、TE溶液で洗浄
２４）通風乾燥して保存
フィルターの洗浄と検出（発光法）
１）15時間のハイブリダイゼーションの後に、100 mlの2× SSC、0.1% SDSの溶液に30秒間浸漬
２）この溶液を捨て、200 mlの同じ溶液を加えて室温で15分間緩やかに振盪
３）この溶液を捨て、200 mlの同じ溶液を加えて室温で15分間緩やかに振盪
４）この溶液を捨て、100 mlの0.5× SSC、0.1% SDSの溶液に30秒間浸漬
５）この溶液を捨て、200 mlの同じ溶液を加えて65℃で15分間緩やかに振盪
６）この溶液を捨て、200 mlの同じ溶液を加えて65℃で15分間緩やかに振盪
７）この溶液を捨て、200 mlのWashing Buffer（100 mM マレイン酸、150mM NaCl、0.3%(v/v)Tween-20R、pH 7.5）を加えて室温で5分間緩やかに振盪
８）この溶液を捨て、Buffer 2（1% Blocking Reagent、100 mM マレイン酸、150 mM NaCl、pH 7.5）で軽く濯ぐ
９）200 mlのBuffer 2を加え、室温で30分間緩やかに振盪してフィルターを平衡化する
１０）この間にAnti-DIG-AP conjugateをBuffer 2に5000倍に溶解
１１）平衡化したフィルターをハイブリバッグに移す
１２）20 mlの１０）を注入
１３）ポリシーラーを用いて空気を出来るだけ追い出して封をする
１４）30分間緩やかに振盪
１５）フィルターをハイブリバッグから出し、200 mlのWashing Bufferの入った容器中において室温で15分間緩やかに振盪
１６）この溶液を捨て、200 mlのWashing Bufferを加えて室温で15分間緩やかに振盪
１７）この溶液を捨て、20 mlのBuffer 3（100 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、50 mM MgCl2、pH 9.5）を加えて室温で10分間緩やかに振盪してフィルターを平衡化する
１８）平衡化したフィルターをサランラップ上に移す
１９）3-4 mlのCDP-Starをフィルターの上にまんべんなく載せる
２０）全体に試薬を行き渡らせ、2-5分放置
２１）フィルターをハイブリバッグから出す
２２）サランラップTM（旭化成）上に移し、空気の入らぬように包む
２３）暗室内でX-Ray Filmをフィルターより大きめに切断する
２４）FUJI EC-A CASSETTEに封入して30分-４時間程度感光（感光させながら、37℃で酵素反応を促進させることもできる）
２５）フィルムを現像して検出